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        cDNA文庫構建的實驗操作步驟

        發布日期: 2021-10-15
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           cDNA文庫構建在研究具體某類特定細胞中基因組的表達狀態及表達基因的功能鑒定方便具有特殊的優勢,從而使它在個體發育、細Chemicalbook胞分化、細胞周期調控、細胞衰老和死亡調控等生命現象的研究中具有更為廣泛的應用價值,是研究工作中最常使用到的基因文庫。
          
          cDNA文庫構建可以:
         ?。?)用于分離全長基因進而開展基因功能研究;
         ?。?)篩選目的基因并直接用于表達;
         ?。?)提供構建分子標記連鎖圖譜的所用探針。
          
          RNA的提取(例如異硫氰酸胍法,鹽酸胍—有機溶劑法,熱酚法等等,提取方法的選擇主要根據不同的樣品而定)Chemicalbook,要構建一個高質量的cDNA文庫,獲得高質量的mRNA是至關重要的,所以處理mRNA樣品時必須仔細小心。
          
          實驗操作步驟:
          1.酚-氯仿對細胞裂解液進行處理,加入結合有polyT的磁珠加入,再吸出磁珠并且洗脫留下mRNA。
          2.瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA是否被裂解。
          3.cDNA第一條鏈的合成:使用polyT作為引物,逆轉錄酶催化第一條鏈的合成。
          4.cDNA第二條鏈的合成(引物合成法)
          4.1.使用末端轉移酶向mRNA-cDNA雜合雙鏈3撇端加入polyC
          4.2.NaOH水解mRNA,純化cDNA的第一條鏈
          4.3.加入polyG作為引物。合成cDNA的第二條鏈
          4.4.純化cDNA,使用單鏈特異性核酸酶對cDNA末端進行處理,形成平末端
          5.cDNA同載體連接:選擇使用λ噬菌體載體,使用限制性核酸內切酶對載體和cDNA進行處理,后使用DNA連接酶將二者連接起來。
          6.體外包裝并轉化進入受體細胞。
          7.藍白斑篩選cDNA文庫。
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